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使用土壤硝酸還原酶測試盒測定的意義及操作方法

更新時間:2022-09-26  |  點擊率:1256
  S-NR催化土壤中硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,是土壤硝態氮還原的關鍵酶。研究S-NR的活性對合理施肥,降低氮素的損失具有重要意義。
 
  測定原理
 
  S-NR催化硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,NO3ˉ+NADH+H+→NO2ˉ+NAD++H2O;產生的亞硝酸鹽能夠在酸性條件下,與對–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成紅色偶氮化合物;生成的紅色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰,可用分光光度法測定。
 
  土壤硝酸還原酶測試盒的操作步驟:
 
  實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫(試劑不能直接在37℃溶解);試劑或樣品稀釋時,均需混勻,混勻時盡量避免起泡。實驗前應預測樣品含量,如樣品濃度過高時,應對樣品進行稀釋,以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍,計算時再乘以相應的稀釋倍數。
 
  1.加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl,余孔分別加標準品或待測樣品100μl,注意不要有氣泡,加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻,酶標板加上蓋或覆膜,37℃反應120分鐘。為保證實驗結果有效性,每次實驗請使用新的標準品溶液。
 
  2.棄去液體,甩干,不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液100μl(在使用前一小時內配制),酶標板加上覆膜,37℃反應60分鐘。
 
  3.溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分鐘,大約400μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
 
  4.每孔加檢測溶液B工作液(同檢測A工作液)100μl,酶標板加上覆膜37℃反應60分鐘。
 
  5.溫育60分鐘后,棄去孔內液體,甩干,洗板5次,每次浸泡1-2分鐘,350μl/每孔,甩干(也可輕拍將孔內液體拍干)。
 
  6.依序每孔加底物溶液90μl,酶標板加上覆膜37℃避光顯色(30分鐘內,此時肉眼可見標準品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色,后3-4孔梯度不明顯,即可終止)。
 
  7.依序每孔加終止溶液50μl,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性,底物反應時間到后應盡快加入終止液。




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